高糖对小鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响(2)

　　取对数生长期细胞，以1000个/孔的密度接种于96孔板中，分别用D-葡萄糖浓度5.0和22.5mmol/L的培养基培养，48h后开始计时，22.5mmol/L葡萄糖预处理组更换含不同浓度D-葡萄糖（5.0、22.5、50、100、150、200、300、500mmol/L）的培养基培养。5.0mmol/L葡萄糖预处理组更换含不同浓度D-葡萄糖（5、22.5、50、100、150、200、250、300mmol/L）的培养基培养。
　　细胞隔天换液，连续培养6d。用MTT法检测细胞的增殖活性，每日1次。方法如下：每孔加入10μL质量浓度为5g/L的MTT，37℃孵育4h，吸出培养基，每孔加入二甲基亚砜（DimethylSulphoxide，DMSO）150μL，于微量振荡器上轻轻震荡混匀10min，用酶标仪（BIORAD550型，美国）测定570nm处的光密度（opticaldensity，D（λ））值。
　　（2）不同糖浓度交替12h培养细胞。
　　取对数生长期细胞，以1000个/孔的密度接种于96孔板中，采用22.5mmol/L的培养基培养48h后开始计时，分别用不同葡萄糖浓度12h交替培养，分组如下：A：N-N（22.5mmol/L持续培养）；B：H50-H50（50mmol/L持续培养）；C：H100-H100（100mmol/L持续培养）；D：H150-H150（150mmol/L持续培养）；E：H50-N（50mmol/L和22.5mmol/L交替培养）；F：H100-N（100mmol/L和22.5mmol/L交替培养）；G：H150-N（150mmol/L和22.5mmol/L交替培养）。其中，A—D为对照组，E—G为观察组。各组细胞每隔12h换液，连续培养8d。用MTT法检测细胞的增殖活性，每日1次。方法同上。
　　1.3统计学处理
　　采用SPSS16.0软件分析数据。数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较用独立样本T检验，多组间比较用单因素方差分析。P<0.05为具有显著性统计差异，P<0.01为具有非常显著性统计差异。
　　鉴于统计检验的局限性[15]，本研究还按照定量差异的方法[16]进行分析。对于任何两个数的绝对值的比值，刘承宜等[16]引入黄金分割常数0.618为底数计算其对数，并将其定义为“定量差异”。通过与队列研究进行比较，刘承宜等[16]将定量差异小于或等于0.27、大于0.27但小于或等于0.47、大于0.47但小于或等于0.80和大于0.80分别定义为“完全没有定量差异”、“稍许定量差异”、“显著性定量差异”和“非常显著性定量差异”。根据文献研究总结，细胞增殖的显著性差异要求定量差异大于0.80。
　　2结果及分析
　　2.1C3H10T1/2细胞增殖的正糖浓度
　　C3H10T1/2细胞在用不同葡萄糖浓度培养之前，分别用22.5mmol/L葡萄糖（表1和3）和5mmol/L（表2）预处理48h。
　　从统计差异来看，表1和2表明，144h时增殖最佳的葡萄糖浓度分别为22.5、50mmol/L。表3观察的时间更长，144、168和192h的情况类似，增殖最佳的葡萄糖浓度只有22.5mmol/L。为了区别不同葡萄糖浓度的增殖效应，本研究将维持细胞增殖的最佳浓度的葡萄糖称为正糖，低于或高于正糖浓度的葡萄糖称为低糖或高糖。按照这个定义，C3H10T1/2细胞系用基础培养基进行体外培养时的正糖浓度是22.5mmol/L。
　　从定量差异来看，表1表明，只有22.5mmol/L与50.0mmol/L一直没有显著性差异。表3表明，只有N-N、H50-H50和H50-N之间一直没有显著性差异。因此，可以将统计差异定出的正糖概念拓展到50mmol/L。
　　2.2细胞增殖的促进效应
　　从统计差异的角度，相对于正糖（22.5mmol/L），高糖有复杂的促进增殖的效应。表1表明，50、100和150mmol/L从24h到96h促进细胞增殖；200mmol/L从24到48h促进细胞增殖；300mmol/L在24h促进细胞增殖。表2表明，100、150、200和250mmol/L在24h促进细胞增殖。表3表明，H50-H50和H100-H100在24h促进细胞增殖；H50-N在48和72h促进细胞增殖；H100-N和H150-N在24和48h促进细胞增殖。从定量差异的角度，相对于正糖（22.5和50.0mmol/L），高糖的促增殖效应非常简单。只有表1发现了高糖短暂促增殖效应。100和200mmol/L在24h促进细胞增殖。150mmol/L在24和48h都促进细胞增殖。
　　2.3细胞增殖的抑制效应
　　从统计差异的角度，相对于正糖（22.5mmol/L），低糖都是抑制效应；除了50mmol/L以外，高糖较长时间的作用都是抑制效应。
　　从定量差异的角度，相对于正糖（22.5和50.0mmol/L），总的趋势与统计差异一样，但抑制增殖的范围比统计差异要小得多。低糖对正糖预处理的抑制只能持续到72h（见表1），对低糖预处理则没有发现抑制效应（见表2）。500mmol/L高糖的抑制效应与统计差异一致（表1）。其它高糖的抑制效应与统计差异的结果相差较大。
　　3讨论
　　3.1葡萄糖浓度对MSCs增殖功能的影响
　　细胞种类不同、培养方式不同，或研究的生理功能不同，维持该功能最佳状态的细胞培养条件也有异，不能一概而论。然而，当前细胞实验中，却存在着依实验目的不同而实验前培养条件不统一的隐性弊端。
　　培养细胞的葡萄糖浓度的混乱来源于对细胞功能定义的混乱。李方晖等[17]首次引入功能内稳态（function-specifichomeostasis，FSH）[18-19]理论来探讨葡萄糖对细胞体外培养的影响。FSH是维持功能充分稳定发挥的负反馈机制。处于FSH的功能称为“正则功能”，远离FSH的功能称为“失调功能”。正则功能当然优于“失调功能”，换句话说，正则功能是局部最优的。随着葡萄糖浓度的增加，成肌细胞增殖逐渐增加，然后逐渐下降[17]。细胞增殖的峰值标志细胞处于增殖内稳态（proliferation-specifichomeostasis，PlSH），相应的葡萄糖和PlSH分别称为正糖和正糖PlSH。浓度低于或高于正糖的葡萄糖称为低糖或高糖，会打破正糖PlSH，导致增殖功能下降。李方晖等[17]发现，维持C2C12成肌细胞正则增殖的正糖浓度为22.5mmol/L。本研究按照统计差异发现的正糖为22.5mmol/L，按照定量差异发现的正糖为22.5和50.0mmol/L。表2表明，22.5和50.0mmol/L不但没有定量差异，而且连统计差异也不存在，这个结果支持定量差异的正糖定义。文献上经常采用25mmol/L葡萄糖作为对照组，也支持定量差异的正糖定义。如下讨论将采用定量差异来展开。
　　正糖对正则增殖的维持还体现在48h的预处理上。表1与表2比较表明，预处理48h后更换高糖培养时，低糖预处理的高糖无法促增殖，但正糖预处理的高糖可以；低糖预处理的高糖抑制效应强于正糖预处理；低糖预处理增强了对低糖的适应能力，但降低了对高糖抑制增殖的抵抗能力。这说明，低糖预处理细胞本身所具备的增殖能力下降，提示低糖降低了C3H10T1/2细胞系的增殖能力。

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