新型产琼胶酶海洋细菌的筛选和鉴定(2)

　　1.1.1 菌株来源大连黑石礁沿海海域自然生长的石花菜。分离培养基（2216E）：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸高铁0.01 g，琼脂20 g，陈海水1 000 mL，pH 7.2～7.8，121 ℃，20 min 灭菌后倒平板。种子培养基：琼脂1 g，其他成分同分离培养基。发酵培养基：同种子培养基。

　　1.1.2 主要试剂及仪器琼脂及其他化学试剂均来自北京奥博星生物技术有限责任公司。JSM-460LV型扫描电镜（英国牛津仪器公司），722型光栅分光光度计（上海分析仪器厂）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 产琼胶酶海洋细菌的分离将采集的50份石花菜样品用剪刀将其剪成细小碎片，置于含有玻璃珠的海水中振荡30 min，取不同稀释梯度的菌悬液涂布在分离培养基，28 ℃培养观察。以能产生琼脂凹陷圈为标准，挑取凹陷圈较大的菌株，单菌落斜面保藏以筛选产琼胶酶性能优良菌株。

　　1.2.2 产琼胶酶性能优良菌株的筛选挑取筛选菌株一环，接入装有5 mL种子培养基的大试管中， 28 ℃，150 r/min摇床培养24 h后，转接到装有30 mL/100 mL发酵培养基的三角瓶中，28 ℃，150 r/min摇床培养48 h，取培养液于8 000 r/min离心5 min后，上清液以DNS法（3， 5 - 二硝基水杨酸法）[9]测量琼胶酶活力。DNS法琼胶酶活力测定方法：取1 mL发酵上清液和1 mL磷酸缓冲液（琼脂0.2 g/L，pH 7.0）于试管内，于40 ℃温浴30 min后加入2mL DNS试剂，混合液在沸水中水浴10 min后用去离子水定容至25 mL，充分混匀后在540 nm处测量吸光度值。酶活力定义：以煮沸灭活的上清液为空白对照，以1 mL酶液1 min产1 μg还原糖定义为1个活力单位。

　　1.2.3 产琼胶酶海洋细菌的电镜形态观察电子扫描电镜观察细胞形态。

　　1.2.4 产琼胶酶海洋细菌鉴定菌株的形态学和生理生化特性的测定：根据《常见细菌系统鉴定手册》所列菌种鉴定的方法进行菌种的鉴定[10]。菌株的16S rRNA基因序列测定和分析： ① 16S rRNA基因序列测定：由宝生物工程有限公司完成。②16S rRNA基因序列结果分析：将所得到的基因序列利用BLAST软件与GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库进行序列比对，获取相近典型菌株的16S rRNA基因序列，采用ClustalX和MEGA软件包进行分析，用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，进行系统发育分析，各枝上的数字是1 000次Bootstrap重抽样分析的支持百分比[11-13]。

　　2 结果

　　2.1 细菌分离结果

　　从50份石花菜样本中分离得到83株菌株，根据琼脂凹陷圈大小得到具有较明显分解琼脂能力的菌株30株（图1A），经卢哥氏碘液染色后产生透明圈（图1B）。

　　2.2 高产琼胶酶菌株的筛选

　　以初步分离得到的30株菌株为出发菌株，测得其48 h琼胶酶活力（表1）。其中酶活力平均值在10以上的菌株有15株，酶活力最高菌株为ZGR-26菌株，达到32.1。由于这些菌株的菌落形态较为相似，认为是同一种菌，所以选取产酶活力最高的ZGR-26菌株进行鉴定。

　　2.3 产琼胶酶菌株ZGR-26的形态、培养特征及理化特性

　　琼胶酶产生菌ZGR-26在2216E固体培养基培养48 h后观察，菌落呈扁圆形凸起，光滑，比较湿润，白色或淡黄色，透明，边缘整齐，无可溶性色素，周边分解琼脂产生透明凹陷。电镜观察，细胞短杆状，（1.0～1.5） μm×（1.5～2.0） μm，无芽孢，革兰氏染色阴性（图2）。

　　ZGR-26的部分生理生化特征见表2。将该菌株与V. agarivorans进行生理生化特征鉴定比较，结果表明菌株ZGR-26所测定的生理生化反应与V. agarivorans作为属间种的鉴别的特征基本相符（但是ZGR-26能利用蔗糖作为碳源，而V. agarivoran则不能），由此初步鉴定该菌为食琼胶弧菌。

　　2.4 16S rRNA基因序列分析

　　将扩增得到的16S rRNA基因片段电泳检测，测得其序列长度为1 458 bp。经BLASTn软件序列分析，结果表明细菌ZGR-26 （KF612972）与食琼胶弧菌（V. agarivorans）同源性最高（表3）。从GenBank中选取和菌株ZGR-26同源性较高的8株菌株的16S rRNA基因序列构建系统发育进化树，结果显示，ZGR-26的遗传进化距离与食琼胶弧菌（V. agarivorans）最近，并在同一分支中，而与此前发现较多的噬琼胶菌（Agarivorans albus）进化距离较远，不在同一进化分支中（图3）。根据菌株的形态学特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，初步鉴定细菌ZGR-26为食琼胶弧菌（V. agarivorans）。

　　3 讨论

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