洋葱Ms位点多重PCR标记的开发与优化(3)

　　对于一个稳定的PCR扩增体系，DNA模板的浓度在一定范围内并不是影响扩增条带强弱的主要因素，因此本研究在1 μL DNA模板（约50 ng）浓度下，先确定主要影响因素，然后设计了7个模板梯度，分别为：0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL，同时以水为阴性对照（CK）。结果表明，模板浓度较低时，扩增效率较低，随着模板浓度的增加，扩增效率越来越高，在设定的模板浓度梯度范围内，未对PCR反应造成抑制（图6）。因此，选择1.0 μL模板DNA加入量进行PCR扩增。

　　2.7优化后的体系和程序

　　通过对扩增体系及反应程序的优化建立了显性Ms和隐性ms等位基因的多重PCR分子标记（MK4）检测系统。25 μL PCR扩增体系包括2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+ free），4 μL 25 mmol/L的MgCl2 （终浓度为4 mmol/L）、6 μL 2.5 mmol/L的dNTP（终浓度为0.6 mmol/L）、DNA模板1 μL （约50 ng）、10 μmol/L的引物各1 μL（终浓度为0.4 μmol/L）、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL（终用量为3 U），用灭菌双蒸水补齐至25 μL，退火温度为65.4℃，35个循环。对MsMs、Msms、msms 3种基因型洋葱育种系进行扩增（图7），结果表明，3种基因型的材料，均得到了清晰可见的目的条带，扩增结果与基因型完全相符。

　　为了验证开发优化的MK4标记，对239株BC1分离群体进行单株检测。结果表明，所有的可育单株均可扩增出905、661 bp两条带，而所有不育单株均只扩增出661 bp条带（图8），标记检测结果与表型完全相符。因此，确定开发的MK4标记能够用于田间材料的鉴定。

　　3结论与讨论

　　本研究通过引物筛选、体系和程序优化获得了一个可同时检测显性Ms和隐性ms等位基因的多重PCR分子标记MK4（UM2、DM2、Um2、Dm2）；PCR扩增体系为10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L的MgCl2 4 μL、2.5 mmol/L的dNTP 6 μL、模板DNA 1 μL（约50 ng）、10 μmol/L引物各1 μL、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL，用灭菌双蒸水补齐至25 μL；扩增程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，65.4℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。该分子标记系统可以通过一次PCR试验鉴定3种Ms座位基因型（MsMs、Msms、msms）的洋葱材料，扩增结果与基因型完全相符。

　　多重PCR反应体系和程序与普通PCR极为类似，除了考虑各组分间的比例及退火温度外，还应首先考虑多重PCR引物间的兼容性，引物的兼容性不好，就会造成扩增效率极低甚至无扩增，无法检出相关的等位基因；第二，应该特别注意dNTP的冻融次数，随着冻融次数的增加，扩增效率降低，然而高浓度dNTP可以部分抵消因冻融次数造成的扩增效率降低的现象；第三，本研究未对引物浓度进行优化，原因为终浓度为0.4 μmol/L时，两个等位基因在表观上的检测亮度基本相似，未出现扩增严重不平衡的现象。但在其它多重PCR的开发和应用中，可以通过调整待检测位点的引物浓度，调节扩增条带的亮度，进而达到便于鉴定识别的目的。

　　参考文献：

　　[1]王振宝，霍雨猛，程斐，等. 洋葱atp6基因的克隆与系统进化分析[J]. 山东农业科学， 2014， 46（1）：10-14.

　　[2]Havey M J. Identification of cytoplasms using the polymerase chain reaction to aid in the extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion [J]. Theor. Appl. Genet.， 1995， 90：263-268.

　　[3]Sato Y. PCR amplification of CMS-specific mitochondrial nucleotide sequences to identify cytoplasmic genotypes of onion （Allium cepa L.） [J]. Theor. Appl. Genet.， 1998， 96： 367-370.

　　[4]Engelke T， Terefe D， Tatlioglu T. A PCR-based marker system monitoring CMS-（S）， CMS-（T） and （N）-cytoplasm in onion（Allium cepa L.） [J]. Theor. Appl. Genet.， 2003， 107：162-167.

　　[5]Kim S， Lee E T， Cho D Y， et al. Identification of a novel chimeric gene， orf725， and its use in development of a molecular marker for distinguishing among three cytoplasm type in onion （Allium cepa L.） [J]. Theor. Appl. Genet.， 2009， 118：433-441.

　　[6]吴雄，修景润，杨妍妍，等. 一种洋葱细胞质雄性不育SCAR标记及其应用：ZL200910014679.9[P]. 2011-09-21.

　　[7]Labani R， Elkington T. Nuclear DNA variation in the genus Allium L. （Liliaceae） [J]. Heredity， 1987， 59：119-128.

　　[8]King J J， Bradeen J M， Bark O， et al. A low-density genetic map of onion reveals a role for tandem duplication in the evolution of an extremely large diploid genome [J]. Theor. Appl. Genet.， 1998， 96：52-62.

　　[9]Gokce A F， Havey M J. Linkage equilibrium among tightly linked RFLPs and the Ms locus in open-pollinated onion populations[J]. J. Am. Soc. Hortic. Sci.， 2002， 127：944-946.

　　[10]Bang H， Cho D Y， Yoo K S， et al. Development of simple PCR-based markers linked to the Ms locus， a restorer-of-fertility gene in onion （Allium cepa L.） [J]. Euphytica， 2011， 179：439-449.

　　[11]Park J， Bang H， Cho D Y， et al. Construction of high-resolution linkage map of the Ms locus， a restorer-of-fertility gene in onion （Allium cepa L.） [J]. Euphytica， 2013， 192：267-278.

　　[12]Havey M J. Single nucleotide polymorphisms in linkage disequilibrium with the male-fertility restoration locus in open-pollinated and inbred populations of onion [J]. J. Am. Soc. Hortic. Sci.， 2013， 138：306-309.

　　[13]Yang Y Y， Huo Y M， Wang Z B， et al. Identification of two SCAR markers co-segregated with the dominant Ms and recessive ms alleles in onion （Allium cepa L.） [J]. Euphytica， 2013， 190（2）：267-277.

　　论文榜（www.zglwb.com），是一个专门从事期刊推广、投稿辅导的网站。
本站提供如何投稿辅导，寻求投稿辅导代理，快速投稿辅导，投稿辅导格式指导等解决方案：省级投稿辅导/国家级投稿辅导/核心期刊投稿辅导//职称投稿辅导。


期刊鉴别	论文检测	免费论文	特惠期刊	学术答疑	发表流程

搜索

洋葱Ms位点多重PCR标记的开发与优化(3)