洋葱Ms位点多重PCR标记的开发与优化(2)

　　1.5试验设计

　　1.5.1标准的PCR体系及程序PCR反应总体积为25 μL，其中基因组DNA 1 μL（约50 ng），10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL（终浓度为1.5 mmol/L），2.5 mmol/L dNTP 3 μL（终浓度为0.3 mmol/L），4条10 μmol/L引物均为1 μL（终浓度为0.4 μmol/L），5 U/μL rTaq 0.2 μL（终用量为1 U），用灭菌双蒸水补齐至25 μL。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃保温10 min，4℃保存。PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统上拍照记录。

　　1.5.2多重PCR反应体系及程序的优化在标准反应体系及程序的基础上，先后对Mg2+浓度、dNTP浓度及冻融次数、最佳退火温度、DNA聚合酶及模板DNA的用量进行了优化。

　　2结果与分析

　　2.1不同引物组合的筛选

　　两对显性Ms等位基因特异性引物与两对隐性ms等位基因特异性引物分别组合，共获得4个组合（表2）。4个引物组合在标准体系下，扩增MsMs、Msms、msms 3种基因型的洋葱，结果（图1）表明，只有引物UM2、DM2与Um2、Dm2的组合（即多重PCR标记MK4）在3种不同基因型材料中都扩增出了特征带（Ms：905 bp，ms：661 bp），MK1和MK2几乎没有Ms的特征条带，MK3在Msms基因型材料中Ms特征条带扩增效率低。因此，选择MK4进行PCR反应体系的优化。

　　2.2Mg2+浓度对PCR扩增结果的影响

　　Mg2+是Taq酶活性所必需的，浓度过低时，Taq酶活性显著下降，无特异条带或特异条带扩增不明显，浓度升高时，Taq酶活性增强，扩增效率提高。随着Mg2+浓度的增加，在接近一定数值时，由于出现高盐抑制现象，扩增条带亮度减弱。本研究设计了8个Mg2+终浓度梯度，分别为1、2、3、4、5、6、7、8 mmol/L，由图2可以看出，Mg2+浓度在3～6 mmol/L时，扩增的目的条带均较清晰，因此后续试验采用4 mmol/L MgCl2。

　　2.3dNTP浓度及冻融次数对PCR扩增结果的影响

　　dNTP是PCR扩增反应的原料，其浓度是影响PCR扩增结果的重要因素，并且其冻融次数对多重PCR的扩增有较明显的影响。在优化得到4 mmol/L Mg2+浓度下，设置两个dNTP终浓度（0.3、0.6 mmol/L），同时对dNTP母液的冻融次数进行检测。结果（图3）表明，在1～2次冻融次数（1T～2T）下，均可检测到清晰明亮的扩增产物，随着冻融次数的增加（3～4次，3T～4T），扩增效率逐渐降低。在较低的dNTP浓度下，这种现象更加明显。高浓度的dNTP在一定程度上可以弥补因冻融次数增加而造成的PCR扩增效率降低的现象。为确保检测体系的稳定性，选用0.6 mmol/L dNTP用于后续试验。

　　2.4退火温度对多重PCR扩增结果的影响

　　退火温度是影响PCR反应的重要条件之一，同时它也具有相对的灵活性。在优化得到的4 mmol/L Mg2+和0.6 mmol/L dNTP浓度条件下，对PCR扩增反应的退火温度进行优化，在55℃到68℃之间共设了8个温度梯度。结果（图4）表明，较低的退火温度不会影响PCR反应，当温度超过65.4℃，隐性ms等位基因扩增效率逐渐降低，当温度达到68.0℃时，无扩增，而显性Ms等位基因仍存在有效扩增。为确保显性和隐性等位基因都能够产生高特异性的有效扩增，退火温度选择65.4℃。

　　2.5DNA聚合酶的量对PCR扩增结果的影响

　　在上述优化结果的基础上进行rTaq DNA聚合酶加入量的优化，共设置了8个rTaq梯度，分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 U。结果表明，在设定的范围内，均可以扩增出目的条带，随着rTaq DNA聚合酶加入量的增加，PCR扩增效率逐渐增强（图5）。为了兼顾扩增结果的准确性和试验成本，选择3.0 U rTaq聚合酶进行后续试验。

　　2.6模板DNA的加入量对PCR结果的影响

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