摘要：缝隙连接是胞间通道的集合体，是相邻细胞间的跨膜通道。连接蛋白Cx29、Cx32和Cx46在施万细胞中表达，Cx43在施万细胞和卫星胶质细胞中均有表达，并形成功能性的缝隙连接通道或半通道。缝隙连接蛋白直接或间接参与细胞信号整合，借助连接蛋白磷酸化及定向突变研究，其分子调控机制逐步清晰施万细胞和卫星胶质细胞中连接蛋白及其磷酸化的阐明，有助于解释其在外周神经胶质中的表达与功能调控。 

　　关键词：缝隙连接；施万细胞；卫星胶质细胞；连接蛋白；磷酸化 

　　缝隙连接（gap junction，GJ）是胞间通道的集合体，相邻细胞间的跨膜通道，对胞间小于lkD小分子物质转换起门控作用，例如离子、第二信使（Ca2+、1P3、cAMP和ATP）、营养盐和代谢物。脊椎动物中，缝隙连接是由头对头锚定在一起的半通道（也称连接子）构成，每一半通道由6个连接蛋白（connexin，Cx）构成聚合体。每一Cx包含4个跨膜区（Ml-M4）、两个胞外环和3个胞质区（分别是C-端、胞质环、N-端）。截止目前，已报道小鼠基因组中有20个连接蛋白基因家族成员（命名为Cja/Cjb/Gje），人类基因组中有21个（命名为GJA /GJB/CJE），其中小鼠连接蛋白基因中有19个与人类的存在直系同源，且高度保守，因此，其表达产物均常以Connexin表示。缝隙连接参与机体功能平衡、调节、再生和发展，如在增殖细胞、心脏细胞、肝细胞、视网膜细胞、晶状体细胞等生理功能中均扮演重要角色，在外周神经胶质中更是承担着核心调节功能。 

　　外周神经胶质细胞主要包括施万细胞（Schwann cells，SCs）和卫星胶质细胞（satellite gliacells，SGCs）。SCs包裹在轴突外层，SGCs分布在神经元周围。SCs和SGCs在外周神经系统中，通过缝隙连接维持神经细胞稳态、促进突触形成以及神经信号调制。例如，损伤介导的Cx43可塑性是调停神经敏化和放大疼痛反映的重要因素之一，Cx43抑制剂是神经损伤的镇痛剂。我们新近研究亦显示，鞘内注射缝隙连接阻断剂显著抑制蝎毒诱致的大鼠持续性自发痛、同侧械痛敏等痛相关行为，以及DRG中Cx43、Cx36和Cx32mRNA的行为学相关时程表达。据此推测，缝隙连接参与疼痛且在痛发生发展机制中起重要作用：然而，目前有关外周神经胶质中缝隙连接，参与功能调控等方面的系统阐述尚少。因此，本文对缝隙连接蛋白在外周神经胶质中的表达、磷酸化以及其参与的功能调控进行综述，为今后进一步研究缝隙连接及其潜在功能提供基础理论依据。 

　　1缝隙连接蛋白在外周神经胶质细胞中的表达 

　　1.1缝隙连接蛋白在施万细胞中的表达 

　　Jessen等报道，成熟的SCs起源于多能神经嵴细胞（neural crest cells，NCC），其成熟需经历两个短暂阶段：施万细胞前体（Schwann cell precur-sors， SCPs）和未成熟施万细胞（immature Schwanncells， ISCs）。目前发现Cx29、Cx32、Cx43和Cx46在SCs细胞中均有表达，其中Cx29和Cx32分布在SCs旁节（Paranodes）和施一兰氏切迹（Schmidt-Lanterman incisures），但Cx29主要分布在邻近轴突的SCs膜，特别是靠近旁节区。Cx32在旁节和施一兰氏切迹形成缝隙连接，使得相邻轴突与神经元胞质相连，形成胞间通讯。Cx43在NCC、SCPs和ISCs中均有表达，但在NCC中表达丰度较高，并在NCCs间形成缝隙连接通讯。同时，Cx43在SCPs胞质中也大量存在，且贯穿整个SCs发育过程。神经损伤后SCs中Cx46表达量上升，并且SCs的耦合、增殖与Cx46 mRNA和蛋白的表达水平密切相关，表明SCs间缝隙连接有助于细胞损伤应答。 

　　1.2缝隙连接蛋白在卫星胶质细胞中的表达 

　　卫星胶质细胞（SGCs）是脊髓背根神经节（dor-sal root ganglia， DRG）和三叉神经节（trigeminalganglia，TG）中最重要的胶质细胞类型。感觉神经元是神经信息处理位点之一，SGCs是感觉神经元周围的胶质细胞，紧紧包裹在神经元周围允许小分子物质透过。SGC与SGC间，SGC与神经元胞体间，神经元与神经元间均有缝隙连接偶联，但神经元与神经元间的偶联程度远低于前两种细胞间偶联方式。Cx43在卫星胶质细胞中大量表达，Cx43组成的GJ是相邻SGC及与其神经元偶联的主要方式。 

　　2缝隙连接在外周神经胶质细胞中的作用 

　　2.1缝隙连接在施万细胞中的作用 

　　SCs缝隙连接在周围神经损伤、再生与修复中起关键作用。外周神经损伤后SCs被激活，刺激轴突生长及神经营养因子和转录因子上调。同时，激活的SCs产生胶原蛋白、层粘连蛋白、细胞粘着分子及表达受体，如IL-1、N-钙粘蛋白、γ整联蛋白以及神经细胞粘附分子（N-CAM）等，参与损伤应答与修复。此外，SCs通过缝隙连接调控离子流（Na+，K+），参与机体生理调控过程。 

　　Cx29在NCC分化成SCPs的过程中开始表达。Cx29缺陷的小鼠并没有表现出SCs紊乱。在SCs中，对Cx29亚结构定位结果表明，其在神经元和胶质细胞相互作用中具潜在作用。有证据表明，Cx29并不形成缝隙连接功能，但其在SCs发育过程中很重要。Cx29 mRNA在外周神经中的含量非常丰富，Li等利用Cx29抗体研究也确定了Cx29在坐骨神经中的表达和定位。转染的HeLa细胞中存在Cx29，RT-PCR和免疫组化分析，提示了Cx29的半通道功能。Altevogt等研究发现Cx29与轴突膜附近的Kvl.2 K+通道偶联，表明Cx29半通道参与髓鞘轴浆K+转运。因此，Cx29具半通道活性，它直接参与髓鞘轴浆K+转运，轴突信号转导以及SCs增殖分化。

　　Cx32蛋白是由GJBl/Gjb1基因编码的，目前至少发现400种Cx32突变体，SCs上Cx32突变导致遗传性周围神经运动和感觉病变综合症-X-连锁腓骨肌萎缩症（X-linked charcot-marie-toothdisease，CMTIX）。Cx32突变致使通道功能缺陷，特别是阻止了第二信使分子的扩散，从而使相邻细胞功能紊乱。N-端突变导致Cx32生物物理特性改变和门控极性反转，突变半通道两个胞内环上半胱氨酸残基导致通道功能缺失，而突变胞内环和C-端区域则影响pH门控。转基因小鼠中突变SCs Cx32基因位点R75W和T551，不能形成Cx32缝隙连接通道功能，但不会影响其他缝隙连接蛋白的表达（如Cx29）。此外，突变Cx32也会增加非结合膜表面半通道的开放，降低离子梯度和小的代谢物，增加Ca2+的涌入，对细胞造成损害。因此，Cx32在缝隙连接通道物理特性、门控特性、通道特性以及Ca2+信号等功能调控中具重要作用。 

　　2.2缝隙连接在卫星胶质细胞中的作用 

　　缝隙连接在神经痛和炎性痛中扮演重要角色，研究表明SGCs通过缝隙连接调控离子浓度和神经兴奋性。神经元与SCCs间的缝隙连接促进非突触化学递质扩散。Ohara等已证明SGCs间是通过缝隙连接偶联，调节神经细胞周围环境从而维持神经元的稳态。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic prolein，GFAP）表达的增加和细胞增殖被用来指示SCCs神经损伤应答。因此，可以用GFAP及连接蛋白来标记伤害刺激下缝隙连接通道的表达变化，进而为阐明其参与疼痛调控机制提供证据。 

　　外周损伤引起SGCs显著改变，Pannese等（2003）切断小鼠坐骨神经导致DRG上SCCs间偶联增加，且电镜证据表明这种增加与缝隙连接增加密切相关。神经损伤活化SGCs，使SGCs间通过缝隙连接偶联，胶质细胞偶联对胞外高K+起缓冲作用，产生异常神经活性和慢性痛。神经损伤使得动作电位增加，从而介导神经元释放ATP以及激活神经元周罔SGCs上P2受体，胞质Ca2+增加，产生疼痛。高K+使得SGCs间以及SGCs与神经元间去极化，从而使Ca2+流人，神经元释放化学信号，改变胞间偶联。SGCs中的缝隙连接蛋白缺陷致使细胞功能紊乱；采用RNAi技术沉默正常大鼠中Cx43表达致使胞外K+增加，K+平衡被打破，引致痛敏增加；进而，在神经损伤大鼠中沉默Cx43，使得谷氨酸循环途径中断，可起镇痛作用。神经损伤后，SGCs中的缝隙连接大量增加来应对ATP和谷氨酸的增加。此外，降低正常动物Cx43的表达导致白发痛和诱发痛行为。这些结果表明，SGCs的Cx43缝隙连接通道在疼痛调控中具有重要作用。 

　　3连接蛋白磷酸化在外周神经胶质细胞中的功能调控 

　　缝隙连接通道受膜电乐、pH、连接蛋白磷酸化等的调控。连接蛋白磷酸化有助于缝隙连接通道的选择性，驱动缝隙连接通道内化和降解，从而使通道激活或失活。不同连接蛋白磷酸化作用不同，大多连接蛋白磷酸化位点位于C-端，极少数位于胞质环，而N—端几乎没有。 

　　3.1Cx43磷酸化 

　　Cx43磷酸化是由多种蛋白激酶介导的动态过程。12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（12一O一tetradecanoylphorbol -13-acetate，TPA）重叠致使Cx43丝氨酸磷酸化从而介导缝隙连接下调和改变Cx43 SDS-PAGE迁移率。激活PKC增加Cx43磷酸化，降低缝隙连接通讯，不同蛋白激酶作用Cx43磷酸化位点不同，MAPK磷酸化Cx43 C一端丝氨酸255、279和282位，PKC磷酸化Cx43 C一端丝氨酸368和372位，p34cdc2磷酸化Cx43 C一端丝氨酸262位，CK1磷酸化Cx43 C一端丝氨酸325、328和330位，PKA磷酸化Cx43 C一端丝氨酸364、365、369和373位，v-Src磷酸化Cx43 C一端酪氨酸247和265位。且不同磷酸化位点扮演的角色不同，C-端酪氨酸247位或265位磷酸化降低缝隙连接通讯和Cx43的定位，丝氨酸325、328和330位磷酸化调控缝隙连接组装。研究表明，连接蛋白磷酸化调控细胞周期缝隙连接通讯，如PKC激活介导的Cx43磷酸化降低G0期到S期缝隙连接通讯，p34cdc2介导的Cx43磷酸化下调G2/M期缝隙连接通讯，S期和G2/M期磷酸化Cx43丝氨酸368位降低缝隙连接组装。胰腺癌细胞中Cx43丝氨酸279和282位的磷酸化能调节其内吞作用和缝隙连接组装。MAPK多重磷酸化Cx43，致使壁颗粒细胞之间的缝隙连接通道关闭和内化。 

　　以上证据表明，Cx43具多重磷酸化位点，不同位点磷酸化在缝隙连接通道合成、组装、内化以及调控等生理过程中具重要作用，且涉及众多生理病理过程，但其参与调控机制仍不明了。因此，体内Cx磷酸化对胞间信号分子调控蕴含巨大研究空间。 

　　3.2其他Cx磷酸化 

　　Cx具多重磷酸化位点，由不同蛋白激酶激活，调控GJ通讯。不同蛋白激酶激活的Cx氨基酸磷酸化位点也各有不同，PKA/PKC激活Cx32丝氨酸233位，内皮生长因子受体激酶激活Cx32酪氨酸残基。增加胞内cAMP水平或胞内注射PKC激活剂均提高Cx32磷酸化水平，影响CJ特性，激活胞内PKA将瞬间增加Cx32通道电导，阻止其被钙蛋白酶水解，调控通道活性。 

　　现已证明Cx46 C-端丝氨酸残基118位和493位可被磷酸化，激活胞内PKC可磷酸化Cx46丝氨酸118位，降低了PKCy依赖通讯。目前关于Cx46磷酸化的研究主要集中于视觉晶状体，Cx32缺失则致使X-连锁腓骨肌萎缩症，而在神经系统中调控作用研究的很少，有关Cx29磷酸化问题的报道几乎没有。尽管已明确缝隙连接参与疼痛信号通路，其机理却不明了。因此，进一步探明Cx磷酸化及其功能调控作用，仍将是缝隙连接通道研究的主要内容。 

　　4结语 

　　SCs和SGC是两种重要的外周神经胶质细胞，缝隙连接通道蛋白缺陷，将诱发疾病并影响疼痛反应。随着研究的不断深入，相信外周神经胶质缝隙连接与疼痛的关系将越来越清楚，将有可能成为疼痛治疗新靶点。目前研究Cx多以RT-PCR、Western-blot、免疫组化的方法，但仅有少量以磷酸化为靶点，探究Cx的表达特性及功能。而磷酸化在通道选择性、极性方面至关重要，大多数连接蛋白家族成员中都存在潜在的磷酸化调控作用，但截止目前也仅Cx43磷酸化相对较为清楚，Cx其他亚型磷酸化的研究则较为滞后。此外，除磷酸化外，其他的调控方式也有待深入研究。因此，DRG与其他功能脑区中Cx生理病理功能调控机制的研究仍有巨大的方法学和生物学拓展空间。