抗稻瘟病链霉菌JK—1基因组BAC文库构建(2)

　　1.2.3 BAC文库的构建回收的大片段DNA与载体按1∶1、5∶1、10∶1的比例进行连接，筛选最佳连接比例。连接产物用30%PEG8000透析，脱盐和浓缩。然后取2μL连接产物转化20μL感受态细胞ElectroMAX DH10B T1 Phage-Resistant（Epicentre公司），转化条件：1.25kV/cm，200Ω，25μF。转化产物中加入980μL的SOC培养基，37℃振荡培养1h，涂布LB平板（12.5μg/mL氯霉素、80μg/mL X-gal和100μg/mL IPTG），37℃倒置培养18h，通过蓝白斑筛选，鉴别可能的重组克隆[8]。挑取白色菌落，LB液体培养基37℃ 225r震荡培养18h，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，用I-SceI酶切检测插入片段大小和空载率。最后挑取白色克隆到含有70μL冻存培养基的384孔培养板里，37℃培养至培养基液变浑浊，用384针的Replicator将文库复制2份，一并贮存于-80℃低温冰箱保存。

　　1.2.4 BAC文库的质量分析从制备好的BAC文库中随机挑取100个克隆，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，用I-SceI酶切，脉冲电泳检测插入片段大小，脉冲条件：1%琼脂糖凝胶，1×TAE，泵70，温度12℃，电压6V/cm，角度120°，脉冲时间5～15s，运行15h。计算平均插入片段大小和空载率，估算全基因组覆盖度。

　　2 结果与分析

　　2.1 高分子量DNA制备与检测本研究采用菌丝包埋法制备plug，制备好的plug经酶解释放DNA，蛋白酶K消化处理，脉冲电泳检测表明该方法提取的基因组DNA质量高，片段大，DNA降解少，完全能满足建库需求（图1）。

　　[M 1 2 3]

　　图1 链霉菌JK-1 HMW DNA脉冲电泳

　　注：M：Low range PFGE Marker（NEB产品）。1、2、3泳道为提取的基因组DNA。脉冲电泳条件：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，5～50s，16h。

　　2.2 基因组DNA酶切酶切后脉冲结果显示，第4道的大部分片段集中在50～150kb，所以1/3的plug所用酶量在1.2U和2.4U最佳（图2）。以此为基础进行大量酶切，回收50～100kb及100～150kb的片段。

　　[M 1 2 3 4 5 6]

　　图2 链霉菌JK-1 HMW DNA的BamHI不完全酶切

　　注：M：Low range PFGE Marker（NEB产品）。1～6泳道为1/3 plug分别为0，0.3U，0.6U，1.2U，2.4U，3.6U的BamHI于30℃酶切10min的结果。脉冲电泳条件为：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，0.1～40s，16h。

　　2.3 大片段选择回收本实验用1.2U BamHI对plug进行了大量酶切，然后用脉冲场电泳分离，切下50～150kb的大片段，再分割成50～100kb、100～150kb的2个胶块，进行第2次片段选择。经过2次选择，有效地去除了较小的片段。

　　2.4 连接与转化电泳结果显示本实验的载体质量高纯度好。本实验设置了片段与载体1∶1、5∶1、10∶1这3个梯度连接比例。结果显示，在5∶1的比例下，长出的克隆数目明显多于其它连接比例。连接后的产物经偷袭除盐处理以提高转化效率。

　　2.5 BAC文库质量检测随机挑取100个克隆，接种到5mL含有12.5μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃ 240r/min培养12h，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，I-SceI酶切检测插入片段的大小。统计结果显示插入判断长度集中于50～100kb，平均大小55kb，医学论文文库空载率低于5%（图3）。链霉菌基因组大小约10M。本文库共有3 456个克隆，覆盖了链霉菌JK-1基因组至少17.3倍。

　　[M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13]

　　图3 随机挑取13个链霉菌JK-1 BAC克隆的I-SceI酶切片段大小图谱

　　注：M：Low range PFG Marke（NEB产品），1～13泳道为BAC克隆的I-SceI酶切结果。脉冲电泳条件为：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，5～15s，16h。（下转129页）

　　（上接18页）3 讨论

　　本文所用的BAC载体pCUGIBAC1由pIndigoBAC536和pGEM-4Z 2个载体连接而成，该载体综合了传统BAC载体稳定性好和链霉菌整合型载体的优势，完全满足了本实验的要求。在制备高质量DNA时是将菌丝体先包埋到低熔点琼脂糖之后，再用1mg/mL的溶菌酶消化菌丝体释放DNA，该方法规避了链霉菌基因组DNA容易被氧化而发生降解的缺点。制备好的基因组DNA经脉冲电泳二次回收选择，去除了中小片段等杂质片段的干扰，使得回收片段长度均一，从而有效提高了连接效率和转化效率。

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