S180瘤株对动物模型体内荷瘤的影响及致瘤机制(2)

　　1.1.3 仪器酶联仪型号为ZS-3，由北京新风机电技术公司制造；电子天平型号为SPN202F，购自梅特勒-托利多常州称重设备系统有限公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 小鼠实体瘤模型的建立取健康昆明系小鼠6只，雌雄各半，腹腔注射液体石蜡油0.5 mL/只，7 d后腹腔接种S180细胞，0.5 mL/只，9 d左右见小鼠腹部涨大，按之有波动感后，断颈处死，无菌条件下分别取出腹水，用RPMI1640培养基洗涤2次后制成细胞悬液。

　　1.2.2 实验小鼠分组和给药取小鼠36只，按体重随机分为3组即空白组、模型组、环磷酰胺组，每组12只，6只/笼。核心期刊查询除外空白组，小鼠右腋皮下接种S180细胞悬液，0.1 mL/只，制成小鼠实体瘤模型[3]。空白组：每日口服灌胃生理盐水（NS），0.5 mL/只；模型组：接种肿瘤细胞后，每日口服灌胃1%羧甲基纤维素钠（CMC）溶液，0.5 mL/只；环磷酰胺组：接种肿瘤细胞后，每日注射环磷酰胺注射液0.02 g/（kg·d）[4]，连续10 d，第11天测量小鼠体重并眼球取血，断颈处死后留取肿瘤组织，-80℃冻存备用。

　　1.2.3 小鼠实体瘤瘤体的获取三组小鼠经10 d连续给药后，在末次给药之后的24 h，经测量全部小鼠的体重后颈椎脱臼处死并且解剖，分别剥离其瘤体，清除非肿瘤组织，称取重量，计算平均重量，计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率=（模型组平均瘤重-环磷酰胺组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。

　　1.2.4 组织蛋白的制备每组小鼠各取4个肿瘤物混合后放入预冷的组织研磨器内，空白组选取部位为小鼠上肢部分肌肉。每个研磨器内加入裂解液500 μL，内含蛋白酶抑制剂（PMSF）2 μL，冰上研磨30 min后转入离心管中，静置10 min后12000 r/min低温离心15 min（4℃），吸取上清，以备蛋白含量检测。

　　1.2.5 蛋白质浓度测定采用BCA法。将制备好的组织蛋白利用蛋白定量试剂盒进行含量检测。

　　1.2.6 蛋白免疫印迹（Western blot）法取50 μg蛋白加入等体积的蛋白变性液，煮沸10 min后，进行12%的SDS-PAGE电泳，然后电转至PVDF膜、封闭后，分别加入P53、P21、Bcl-2一抗，4℃过夜，TBST缓冲液洗膜后，加入HRP标记好相应的二抗，待洗膜后，用发光试剂盒ECL法在暗室中发光、曝光、显影、定影。具体方法参考文献[5]。

　　1.2.7 图像分析采用Alpha Ease FC 4.0软件进行光密度分析，以β-actin条带的平均光强度为内参照，结果以蛋白的相应水平与β-actin的比值表示。

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肿瘤生长小鼠的一般情况

　　模型组肿瘤小鼠明显出现精神萎靡不振、食欲较差、畏寒群聚、扎堆、体毛稀疏且干涩、动作迟缓而懒动的情况，个别出现瘤皮破溃、腹水形成等生理的异常变化，并且有3只动物死亡；而环磷酰胺组小鼠的状况较模型组好，但极个别也有少毛和脱毛、精神萎靡、懒动等情况，有1只小鼠死亡。

　　2.2 S180肉瘤对小鼠肿瘤形成的影响

　　模型组小鼠在接种后出瘤现象早，发展快，在剥离瘤块时有不易剥离现象，有的质地软烂，有的分界不清，有的甚至粘连到锁骨和胸骨，说明模型组小鼠荷瘤成功。与空白组比较，模型组出现肿瘤，模型组肿瘤与环磷酰胺组比较，瘤重显著增大，两组差异有高度统计学意义（P < 0.01），环磷酰胺抑瘤率为83.63%。见表1。

　　表1 各组肿瘤组织情况（x±s）

　　注：与模型组比较，*P < 0.01；“-”表示无数据

　　2.3 肿瘤组织中各蛋白表达情况

　　空白组与模型组、空白组与环磷酰胺组比较，3种蛋白表达水平差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；与环磷酰胺组比较，模型组P53、P21表达量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），其中，P21表达差异有高度统计学意义（P < 0.01），而Bcl-2表达变化不大，差异无统计学意义（P=0.66）。见表2、图1。

　　表2 三组P53、P21、Bcl-2蛋白表达水平比较（x±s）

　　注：与空白组比较，②P < 0.01 ；与模型组比较，③P < 0.05，④P < 0.01

　　1.模型组；2.空白组；3.环磷酰胺组

　　图1 Western blot 法检测3种蛋白表达情况

　　3 讨论

　　肿瘤是危害人类健康的主要疾病，正日益受到人们关注。世界各国均对该类疾病的防治与研究进行了大量颇有成效的工作，取得显著进展。在临床上一般采用手术疗法、化学疗法和放射疗法治疗，但是到目前为止还没有一种方法可以彻底根治肿瘤。在针对肿瘤的致病机制和治疗研究中，S180瘤细胞株是常用的研究模型。许多研究表明，S180的致瘤性有时会消失，但是具体原因还不得而知[6]。环磷酰胺在体内氧化生成中间产物醛磷酰胺（aldophosphamide），是通过肝细胞色素P450而完成的，磷酰胺氮芥（phosphamide mustard）从肿瘤细胞内被分解出来再与细胞的DNA发生烷化作用，形成交叉联结，从而抑制肿瘤细胞的生长繁殖[7]。因此，其常被用于肿瘤研究中的阳性对照。

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