摘要：采用组织培养与温室栽培相结合的方法，对生产铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）药材的阶段式培养和栽培模式进行研究。结果表明，在光照度1 500～2 000 lx，光照时间12 h/d，培养温度（25±1） ℃条件下，1/2 MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的组合有利于铁皮石斛组培苗生长，生物量可达（4.29±0.11） g/株。组培苗10～15 cm高时，以腐殖质土为栽培土，温度23～25 ℃，光照条件中度遮阴（50%遮阴度），有利于铁皮石斛次生代谢产物的积累。组织培养能加快繁殖和促进试管苗生长，使生物产量快速增加；腐殖质土栽培能促进其有效成分的合成。将组织培养与腐殖质土壤栽培技术相结合，建立了铁皮石斛的阶段式培养和栽培模式。

 

　　关键词：铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）；组织培养；温室栽培；阶段式培养

 

　　中图分类号：R282；S62 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1599-03

 

　　The Staged Training and Cultivation Mode of Dendrobium officinale Kimura et Migo

 

　　ZHANG Jin-yan1， ZHAO Hong-yan2， HAO Su-yu1， HAN Qiong1，LIU Yi-qiong1，WANG Tai-xia1

 

　　（1.College of Life Science， Henan Normal University，Xinxiang 453007，Henan，China；

 

　　2. Department of Life Science and Technology， College of Xinxiang， Xinxiang 453000， Henan，China）

 

　　Abstract： The staged training and cultivation mode of Dendrobium officinale Kimura et Migo was studied with the combination of tissue culture and greenhouse cultivation. The results showed that under the condition of the light intensity 1500～2 000 lx， irradiation time 12 h/d， culture temperature （25±1） ℃， 1/2 MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA was better for tissue culture seedlings of Dendrobium officinale Kimura et Migo to grow. The biomass growth reached as high as （4.29±0.11） g per plant. When the height of tissue culture seedlings was 10～15 cm， using the humus soil as cultivated soil， temperature 23～25 ℃， light intensity 50% full light was conducive to the accumulation of Dendrobium officinale Kimura et Migo secondary metabolite. Tissue culture could accelerate the reproduction and promote the growth of plantlets， increase the biomass rapidly. Humus soil cultivation can promote the synthesis of effective components. The staged training and cultivation mode of Dendrobium officinale Kimura et Migo was established by combining the tissue culture with humus soil cultivation technology.

 

　　Key words： Dendrobium officinale Kimura et Migo； tissue culture； greenhouse cultivation； staged training

 

　　铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）又称铁皮兰，隶属于兰科石斛属，多年生附生性草本植物，新鲜或干燥茎入药[1]，具有清热驱毒、调理胃、滋润肺部、防止干咳等功效，市场需求量大[2]，其药效成分主要为多糖和生物碱等[3，4]。铁皮石斛种子单独栽种发芽率相当低，与某些真菌类共生才能保证一定的发芽率。所以用栽种普通植物的传统方法种植石斛类的种子很难保证其生长量。加之铁皮石斛多生长于阴湿环境中，自然生长和人工栽培缓慢，收获产量低，供不应求。因此，近年来研究者开展了大量有关铁皮石斛组织培养的研究，成功进行了铁皮石斛分化诱导和快速繁殖[5]。然而，试管苗虽然繁殖系数高、生长快，但有效成分含量低，且植物体内有较高的植物生长调节剂残留，影响用药安全。本研究旨在将组织培养繁殖系数高、生长快的优势与土壤栽培利于有效成分合成、用药安全优势相结合，建立一种铁皮石斛的阶段式培养和栽培模式，为后续研究应用提供参考。

 

　　1 材料与方法

 

　　1.1 材料

 

　　铁皮石斛试管苗，由信阳师范学院生理学实验室培养。

 

　　1.2 方法

 

　　1.2.1 铁皮石斛试管苗快速繁殖和生长条件优化 将铁皮石斛幼茎切成0.8 cm的茎段，分别接种在含有不同浓度的NAA、6-BA的1/2 MS培养基上。在（25±1） ℃[6]条件下，光照度分别为500、1 000、

 

　　1 500、2 000、2 500 lx，筛选适于铁皮石斛快速繁殖和生长的组织培养条件，以获取较大生物产量，并测定其繁殖系数[7]。

 

　　1.2.2 铁皮石斛温室栽培条件优化 当铁皮石斛组培苗长至10～15 cm时，用清水冲洗干净根部培养基，待苗局部晾干且可见水分的程度即可进行移栽。栽培的培养基质选用腐殖质土。将苗栽在花盆中，每花盆种植3～5株。温室温度控制在23～25 ℃，空气湿度控制在75﹪以上，每天喷雾1～3次，1个月喷洒1次大量溶液，适量通风。设置不同光照条件，重度遮阴（80%遮阴度）、中度遮阴（50%遮阴度）、轻度遮阴（30%遮阴度），研究光照条件对铁皮石斛生长的影响，3个月后测定生物量和茎中有效成分含量，分析不同光照条件对铁皮石斛苗生长状况和有效成分含量的影响。

 

　　1.2.3 铁皮石斛茎中有效成分的测定

 

　　1）铁皮石斛多糖含量的测定。取铁皮石斛茎，在60 ℃烘箱烘干至恒重，用粉碎机粉碎，过60目筛。精确称取铁皮石斛粉末1 g，置于索氏提取器中，用丙酮脱脂处理24 h后，放在空气中待丙酮完全挥发。将经过处理的样品加入含有400 mL去离子水的超声反应杯中，制定超声条件，进行超声辅助提取。提取结束后抽滤，滤液集中至30 mL，加入10 mL Sevag试剂（氯仿∶正丁醇=5∶1），摇床振荡30 min脱蛋白后，10 000 r/min离心10 min，把上清液再重复脱蛋白，3次重复。脱蛋白后的滤液缓慢加入95%乙醇，至乙醇为80%，4 ℃冰箱静置48 h后离心，取沉淀。用适量去离子水复溶后定容至100 mL，随后冷冻干燥。精确吸取样品溶液1 mL，稀释100倍后取1 mL用于绘制葡萄糖标准曲线[8，9]，计算样品中多糖的含量。

 

　　多糖含量=[（从标准曲线查得糖的含量/样品溶液的体积）×提取液体积×（稀释倍数/样品重量）×106]×100%

 

　　2）铁皮石斛总生物碱含量的测定 精确称取铁皮石斛粗粉0.50 g，用适量氨水湿润，密封放置30 min，精确加入氯仿10.0 mL，置于水浴上加热回流2 h，冷却后称重，用氯仿补足失重，过滤。取滤液2.0 mL于分液漏斗中，加氯仿溶液8.0 mL（稀释5倍），作为样品溶液。然后精确量取样品溶液10 mL，将样品溶液按测定生物碱含量标准曲线的操作步骤进行操作。同时精确量取石斛碱对照品溶液2.0 mL置于分液漏斗中，同法操作，测定其吸光度，计算总生物碱含量[10]。

 

　　总生物碱含量=（样品溶液吸光度×20 μg）/（标准品吸光度×样品总体积×吸取样品溶液的体积）×100﹪

 

　　2 结果与分析

 

　　2.1 植物生长调节剂对铁皮石斛试管苗繁殖系数和生物量的影响

 

　　在光照时间12 h/d，培养温度（25±1） ℃条件下，以1/2 MS为培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂组合，研究不同植物生长调节剂组合对铁皮石斛试管苗繁殖系数和生物量的影响，结果如表1所示。NAA和6-BA两种生长素交互作用下对铁皮石斛试管苗的繁殖系数影响较大，不同激素浓度组合之间有明显差异。0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA组合繁殖系数最大，达到7，其次是0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA和1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA组合；铁皮石斛试管苗平均生物量最高的组合也是0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，为（4.29±0.11） g/株，其他浓度组合下生物量较小。

 

　　2.2 光照度对铁皮石斛试管苗繁殖系数和生物量的影响

 

　　以1/2 MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的组合进行快繁培养，在光照时间12 h/d， 培养温度（25±1） ℃条件下，研究了不同光照度对铁皮石斛试管苗繁殖系数和生物量的影响。结果（表2）表明，最适于铁皮石斛试管苗生长的光照度为1 500、2 000 lx，在这两个光照度下铁皮石斛平均生物量均大于4.00 g/株，高于其他光照条件下的生物量。

 

　　2.3 光照条件对栽培铁皮石斛生物量和有效成分含量的影响

 

　　组培苗长至10～15 cm高时，将苗移栽到盛有腐殖质土的温室花盆中，温度控制在23～25 ℃，空气湿度75﹪以上。通过遮阴形成不同光照条件，3个月后测定单株鲜重和有效成分含量，分析不同光照条件对铁皮石斛苗生长状况和有效成分含量的影响，结果如表3所示。不同光照条件对栽培铁皮石斛生物量和有效成分含量的积累有明显影响，中度遮阴的情况下，铁皮石斛生物量较高，也有利于有效成分的合成和积累，其有效成分含量与轻度遮阴下相近。

 

　　2.4 试管苗和栽培铁皮石斛有效成分的比较

 

　　分别测量铁皮石斛试管苗和栽培苗茎中多糖、总生物碱含量，结果表明铁皮石斛试管苗中总生物碱含量很少，多糖含量也较低。温室栽培3个月后，铁皮石斛茎中有效成分明显提高，总生物碱含量是试管苗的2.67倍，多糖含量是试管苗的2.25倍（表4）。说明在本试验过程中，组织培养条件下虽然铁皮石斛繁殖生长较快，但不利于生物碱、多糖等有效成分的合成和积累。温室栽培条件下，虽然生长较慢，但有利于有效成分的形成。

 

　　3 结论与讨论

 

　　由于铁皮石斛自身繁殖能力低和人为过度采挖，造成野生资源濒临灭绝[11]，1992年被《中国植物红皮书》列为濒危植物。为缓解铁皮石斛资源短缺问题，近年来浙江、云南、四川、广西等地开展铁皮石斛的组培快繁和大规模人工种植。组织培养可以在短期内提高繁殖系数、增加生物量，且不受自然环境条件的限制。但本试验条件下，通过组培快繁生产的试管苗，其有效成分含量较低，且多数情况下生长在培养基上的试管苗植物生长调节剂残留较高。因此，试管苗不宜直接作为药材应用。

 

　　与组织培养比较，温室栽培具有成本低、有效成分含量高和植物生长调节剂残留含量低等优势。温室栽培铁皮石斛已成为目前石斛药材的重要来源。但由于铁皮石斛根系不发达，尤其是根毛不发达，影响其对土壤中营养成分的吸收，且其叶片小而少，光合效率低。因此，自然生长和温室栽培的铁皮石斛生长较慢，通常2～3年才能达到药材标准。本试验结果表明，组织培养能加快繁殖并促进试管苗生长，使生物产量快速增加；腐殖质土栽培能促进有效成分的合成。将组织培养与腐殖质土壤栽培技术相结合，建立了铁皮石斛的阶段式培养和栽培模式。通过进一步优化铁皮石斛的阶段式培养和栽培模式，将有利于提高铁皮石斛药材生产的效益。

 

　　参考文献：

 

　　[1] 国家环境保护局，中国科学院植物研究所. 中国珍稀濒危保护植物名录[M].北京：科学出版社，1987.

 

　　[2] 中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2010.

 

　　[3] 邵 华，张玲琪，李俊梅，等.铁皮石斛研究进展[J].中草药，2004，35（1）：109-112.

 

　　[4] 陈晓梅，郭顺星. 石斛属植物化学成分和药理作用的研究进展[J]. 天然产物研究与开发，2001，13（1）：70-74.

 

　　[5] 李进进，廖俊杰，许继勇，等.铁皮石斛试管苗栽培技术研究[J].中药材， 2006， 29（11）：1133-1134.

 

　　[6] 吴志刚，刘贤旺，张寿文.石斛属植物组织培养研究进展[J].中药研究与信息，2005，7（11）：24-25.

 

　　[7] 雷祖培，余宏傲，张书润，等.不同植物生长调节物质和培养基对浙江雪胆组培苗繁殖系数的影响[J].浙江农林大学学报，2011，28（4）：662-666.

 

　　[8] 朱美静，童群义.猴头多糖脱蛋白方法的研究[J].河南工业大学学报，2005，26（4）：25-27.

 

　　[9] DUBOIS M， GILLES K A， HAMILTON J K，et al.Colormetric method for the determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

 

　　[10] 李亚芳，张晓华，孙国明.石斛中总生物碱和多糖的含量测定[J].中国药事，2002，16（7）：426-429.

 

　　[11] 陈瑞蕊，林先贵，施亚琴.药用石斛及其组培技术研究概要[J].江苏农业科学，2002（5）：65-66.