地鳖虫纤溶酶的三维结构模拟与序列分析

　　摘要：为了研究地鳖虫（EupolyphagesinensisWalker）纤溶酶的溶栓机理，根据地鳖虫纤溶酶成熟肽编码序列，利用生物信息学方法，对地鳖虫纤溶酶进行了结构分析，用Biosun软件的同源模建技术，模拟了其三维结构。利用GOLDKEY软件，对地鳖虫纤溶酶的氨基酸序列进行了分析，讨论了其等电点、亲水性、柔性与催化活性之间的关系。结果表明，地鳖虫纤溶酶的活性中心是组氨酸、丝氨酸和天冬氨酸3个氨基酸残基，位于球蛋白中心凹穴处，底物结合部位是丝氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，该类酶水解纤维蛋白的机理是催化精氨酸-赖氨酸之间的肽键水解。
　　关键词：地鳖虫（EupolyphagesinensisWalker）；纤溶酶；三维结构；序列
　　中图分类号：Q55；R857.3文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）05-1185-04
　　地鳖虫（EupolyphagesinensisWalker）又名土元、土鳖，属节肢动物门昆虫纲蜚蠊目鳖蠊科昆虫，为《中华人民共和国药典》记载的正品药材，是传统的活血化瘀类动物药，其药用功效主要为逐瘀、破积、通络等。广东工业大学纤溶先导药物课题组在进行地鳖虫纤溶活性成分研究时，从该虫体内分离纯化得到了地鳖虫纤溶酶[1，2]，对此类纤溶酶基因DNA序列进行了分析研究，克隆得到其中一种地鳖虫纤溶酶成熟肽cDNA序列（GenBank登录号：DQ396618），并将其用赤毕酵母表达[3]。为了深入探讨地鳖虫纤溶酶的纤溶作用机制，确定其活性中心的位置，本研究利用生物信息学方法，对地鳖虫纤溶酶序列进行多方位分析，并建立了地鳖虫纤溶酶可靠的三维结构模型，揭示了其纤溶机理，为今后进一步研究提供参考。
　　1理论与方法
　　要想了解蛋白质的立体结构，只有将蛋白质溶液结晶，利用X射线衍射分析蛋白质的单晶，通过衍射数据，得到蛋白质的立体结构。但是蛋白质结晶条件苛刻，而且不是所有的蛋白质都能变成单晶。但是利用现代计算机技术，可以对已知氨基酸序列的蛋白质三维结构做出预测，同时还能对蛋白质序列中的每个氨基酸逐个分析，即比较蛋白质模建，又称为同源模建。该方法是目前应用最广的蛋白质三维结构预测方法[4-6]。本研究将地鳖虫纤溶酶的蛋白质序列提交到NCBI的自动比较蛋白质模建服务器Blast上，通过程序自动确定了地鳖虫纤溶酶序列活性中心与底物结合的部位（图1），Biosun软件模拟生成了地鳖虫纤溶酶的三维结构。利用GOLDKEY软件，对地鳖虫纤溶酶全序列的等电点、亲水性、柔性进行分析，利用无模型比对时活性中心氨基酸残基的性质，进一步阐明地鳖虫纤溶酶的纤溶机理。
　　2结果与分析
　　2.1三维结构模拟与评估
　　将地鳖虫纤溶酶蛋白质序列导入Biosun软件，软件自动选取蛋白质Tryp_SPc[cd00190]为模板，模拟目的蛋白质的三维结构，结果见图2。其中a、b、c3个球状模型，分别对应S178、H41、D853个氨基酸残基侧链（羟基、咪唑基、羧基），与胰蛋白酶催化三联体结构一致[7，8]。d、e、f3个肽键链状模型，分别对应于地鳖虫纤溶酶的底物结合部位D172、S193、G195。由三维结构可以看出，底物结合部位和酶催化活性中心都没有α螺旋和β折叠（α螺旋为柱状区，β折叠为板状区），该区域容易发生形变，在催化过程中跟底物结合时产生诱导契合，符合酶催化理论。酶活中心处于这个蛋白质中心的凹穴处，与通常对纤溶酶活性中心的认识一致[9，10]。笔者在前期试验中发现，该酶受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF的抑制，推测其为丝氨酸蛋白酶[1，2]，此推测与生物信息学方法找到的活性中心S178结论一致。
　　对模板蛋白质和目的蛋白质进行同源性比对（图3），Blast软件给出89.9的评分，说明模板蛋白和地鳖虫纤溶酶的同源性比较高，二者序列覆盖率达到99%。随机匹配的可能性为2×10-19，这么小的随机匹配可能性，说明2个蛋白质相同的序列部分，不是偶然出现的，是具有同源性的。二者最大序列的相似度达到43%。以此模板蛋白质进行同源模建，结果可信。
　　2.2GOLDKEY软件的序列分析
　　在地鳖虫纤溶酶三维结构分析中，采用的是同源模建的方法。在预测的时候，其他蛋白质与目标预测物的差异会导致一定程度的偏差。采用GOLDKEY软件对序列的每个残基逐个计算其特性，虽然无法得到三维结构，但是其数据可靠性更好，更能反映目标蛋白质的特性。图4为利用GOLDKEY软件对地鳖虫纤溶酶氨基酸序列的等电点进行模拟。由图4可知，该蛋白质的等电点为9.67。在通常生理环境下，该蛋白质带正电。纤维蛋白通常带负电荷，所以地鳖虫纤溶酶很容易靠近纤维蛋白质，与之结合，表明该酶对血栓有一定的靶向作用。
　　利用GOLDKEY软件对地鳖虫纤溶酶氨基酸序列进行亲水性模拟（图5）。由图5可知，地鳖虫纤溶酶序列中每个氨基酸的亲水值越大，亲水性越强。其中H41为0.5，D85、S178、D172、S193、G195均为0。H41、D85、S178为活性部位，D172、S193、G195为底物结合部位，其亲水值均比较低。在序列中，这6个残基的亲水值都处于局部最低点（相邻残基的亲水值均较高）。对于水溶性球形蛋白质，亲水值较低的氨基酸趋向于蛋白质的内部，亲水值较高的氨基酸趋向于蛋白质的外部，从一级结构上的亲水性推测，H41、D85、S178、D172、S193、G195这6个氨基酸都位于蛋白质的内部，与三级结构相符。
　　利用GOLDKEY软件对地鳖虫纤溶酶氨基酸序列进行柔性模拟（图6）。由图6可知，地鳖虫纤溶酶序列中每个氨基酸的柔性值，其中

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